北京大学生命科学学院のLong Liの研究グループは、Nature Structural & Molecular Biology誌に「TOM-TIM23スーパー複合体を介したミトコンドリアプレタンパク質輸入の分子経路」と題する論文を発表しました。この研究では、ミトコンドリアでのタンパク質輸送を仲介するTOM-TIM23スーパー複合体の構造的および生化学的結果を報告し、ミトコンドリア外膜を介したTOM複合体を介したタンパク質輸入の新しい経路を明らかにし、ミトコンドリア内膜のTIM23トランスポーター複合体のコア構成を再定義しています。
真核細胞で最も重要な細胞小器官の 1 つであるミトコンドリアは、エネルギー供給、細胞内代謝、恒常性、アポトーシスにおいて重要な役割を果たします。ミトコンドリアは、独特の内外二重脂質膜構造を持ち、内部には 1,000 個以上のタンパク質が分布しています。ミトコンドリアタンパク質の 99% は細胞質遺伝子によってコードされ、細胞質内のリボソームで合成され、膜を越えてミトコンドリアに輸送されて機能を果たします。そのため、ミトコンドリアタンパク質の輸送は、ミトコンドリアの活動を維持および調節するために重要であり、関連遺伝子の変異は、ヒトの多くの代謝性疾患や癌の発症と密接に関連しています。 Li Long 氏のグループは、ミトコンドリアタンパク質がミトコンドリアに入る分子メカニズムの探究に取り組んでおり、発表された研究には、ミトコンドリア膜タンパク質が TIM22 輸送複合体を介して内膜に入る経路の解明が含まれています (Zhang Y. et al Cell Research 2021)。ミトコンドリアタンパク質輸送における TOM-TIM23 スーパー複合体の役割は、この研究ではさらに重要です。数十のタンパク質サブユニットから組み立てられたこのスーパー複合体は、ミトコンドリアの内膜と外膜にまたがり、500 を超えるミトコンドリア可溶性タンパク質と膜タンパク質の輸送を制御します。過去 40 年間、研究者は TOM 輸送複合体と TIM23 輸送複合体の個々のサブユニットを広範かつ集中的に研究してきました。 しかし、この超複合体の非常に動的な性質のため、これらのサブユニットがどのように組み立てられてタンパク質輸送経路を形成するかという中心的な疑問に対する理解は、特にエンドソーム膜内の TIM23 複合体については、コア輸送ユニットの構成が非常に不明瞭であるため、依然として非常に限られていました。
本研究では、著者らはまず安定した TOM-TIM23 超複合体の組み立てから始め、さまざまな組み立てスキームを検討し、最終的に輸送基質としてミトコンドリアタンパク質と緑色蛍光タンパク質を融合することを選択し、酵母細胞でタンパク質基質を輸送するための TOM-TIM23 超複合体の中間状態を捉えました。in vitro 精製後、この中間状態はさらなる構造生物学および生化学研究のために安定化させることができました。クライオ電子顕微鏡によるこの中間状態の単粒子解析により、著者らは、外膜に位置する TOM 複合体と内膜に位置する TIM23 複合体の間に直接相互作用があり、ミトコンドリアの内膜と外膜を結び付け、タンパク質基質をミトコンドリア外膜から内膜に効率的に輸送していることを発見しました (図 1a)。特に、TOM 複合体は 4.1 Å の解像度で解像されました。 構造から、Tom40 チャネルサブユニットの内壁内に「極性アミノ酸経路」が存在することが明らかになりました。この経路は種を超えて保存されており、タンパク質基質が折り畳まれていない状態で Tom40 中間孔を通過するのを仲介します (図 1b)。この経路は、生化学実験に基づいて以前に提案された Tom40 の 2 つの膜貫通経路とは異なり、TOM 複合体がさまざまなミトコンドリアタンパク質を効率的に認識して輸送する汎用性を示しています。
図 1. TOM-TIM23 超複合体の構造。(a) TOM-TIM23 超複合体の概略図とクライオ電子顕微鏡構造。(b) タンパク質基質を含む TOM 複合体のクライオ電子顕微鏡構造モデル。(c) Tim17-Tim23-Mgr2 ヘテロ三量体の AlphaFold2 構造モデル
さらに、著者らはタンパク質基質のさまざまな部位に非天然アミノ酸を体系的に導入し、光架橋法を用いてTOM-TIM23の輸送経路におけるタンパク質基質の周囲を調べ、基質が2つの脂質膜を通過するのを直接助けるコアサブユニットを特定した。実験結果では、タンパク質基質のC末端フラグメントが外膜のTom40サブユニットと架橋できることが示され、これは構造観察と一致する結果であった。しかし驚くべきことに、タンパク質基質のN末端フラグメントは内膜のTim17およびMgr2サブユニットの両方と架橋したが、内膜輸送チャネルを構成すると一般的に特定されているTim23サブユニットとは架橋しなかった。この結果は、過去の研究におけるTIM23複合体のコア輸送経路の認識に重大な偏りがある可能性があることを示唆している。 TIM23 のコアトランスポーターサブユニットと経路をさらに特定するために、著者らは AlphaFold2 モデリング、生化学的架橋、酵母遺伝学、ミトコンドリアタンパク質の in vitro 輸送を組み合わせて使用し、TIM23 複合体のコア成分が Tim23、Tim17、および Mgr2 サブユニットからなるヘテロ三量体であり、Tim17 と Mgr2 が向かい合ってチャネルのような構造を形成するのに対し、Tim23 は背中合わせの形で Tim17 に結合し、チャネル形成には関与しないことを発見しました (図 1c)。タンパク質の輸送中、タンパク質基質は Tim17 と Mgr2 によって形成されたチャネルのような構造を通過し、Tim23 サブユニットに直接接触することはありません。 変異誘発実験により、酵母における Mgr2 のノックダウンはタンパク質の転座に影響を与えないことが明らかになり、これは Tim17 と Mgr2 によって形成されるチャネルのような構造には Tim17 のみが必要であることを示唆しています。Tim17 がタンパク質がエンドソーム膜を通過するのに役立つ理由は、そのユニークな表面アミノ酸分布によるものです。一方では、Tim17 はエンドソーム膜の入り口に高度に保存された負に帯電した領域を持ち、局所的なリン脂質二重層構造を破壊し、タンパク質が脂質膜を通過するためのエネルギー障壁を下げることができます。他方では、Tim17 は経路の中央に保存された疎水性領域を持ち、ミトコンドリアの内膜を気密状態に保ち、ミトコンドリアの生理活動に必要な膜電位を維持するのに役立ちます。 さまざまな構造および生化学実験の結果を総合すると、Tim17 サブユニットを中核とする TIM23 複合体は、タンパク質の転座を助けるために混合モードを採用している、つまり、Tim17 は他のサブユニットと動的に結合してチャネルを形成し、タンパク質が膜を通過するのを助けるか、または Tim17 は挿入酵素モードで動作して、チャネル形成を必要とせずに単独でタンパク質の転座を達成する、という結論に達することができます。この結果は、Tim23 サブユニットがコア チャネルを構成するという、この分野で過去 40 年間にわたって抱かれてきた誤解を正すものです。
要約すると、本研究では、タンパク質輸送研究のための新たな戦略を開発し、ミトコンドリアタンパク質がTOM-TIM23スーパー複合体（図2）を介して二重層脂質膜を通過するための重要な経路を明らかにし、内膜TIM23輸送複合体の中核成分に関する長年の現場知識を覆し、タンパク質輸送酵素の動作のまったく新しいモードを発見し、ミトコンドリア生合成の包括的かつ詳細な理解のための強固な基盤を築きました。
図2. ミトコンドリアTOM-TIM23トランスポーター経路
論文の責任著者はLong Liで、2018年北京大学-清華大学生命科学共同センター博士課程の学生Xueyin Zhou、2019年生命科学学院博士課程の学生Yuqi Yang、北京大学クライオ電子顕微鏡プラットフォームのPeng Wang博士、2020年生命科学学院博士課程の学生Shanshan Wangが共同筆頭著者です。Li Long研究室の元技術者Dongjie Sun、2022年生命科学学院博士課程の学生Xiaomin Ou、2021年生命科学学院博士課程の学生Yuke Lianもこの研究に大きく貢献しました。 北京大学生命科学学院の高寧教授と李寧准研究員、中国科学院生物物理研究所の張新正研究員は、クライオ電子顕微鏡データの計算で多大な協力を提供し、北京大学生命科学学院の李青教授と張利琦教授は、それぞれ酵母遺伝学と光架橋実験で重要な指導を提供しました。研究作業は、北京大学クライオ電子顕微鏡プラットフォーム、高性能コンピューティングセンター、生命科学学院計測センター、国家フェニックスタンパク質プラットフォームの支援を受け、膜生物学国家重点実験室、北京大学-清華大学生命科学連合センター、中国国家自然科学基金の資金提供を受けました。
